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      細胞凍存液,高存活率型
      2020年7月20日
      細胞凍存液,基礎型
      2020年7月20日

      25mg/ml G418溶液,無菌

      100.00


      貨號: RBC102S-1.
      描述

      25mg/ml G418溶液,無菌

       

      貨號                                              RBC102S-1

      規格                                              1ml

      無菌狀態                                        無菌

      應用級別                                        生物試劑級別

      生產環境最低要求                            GMP車間

      4C2T體系認證級別                          C3T1

      儲存及運輸條件                               -20℃儲存及運輸

      效期                                             遵儲存及運輸條件穩定24個月

       

      簡介                           

            本品是一種氨基糖苷類抗生素, 是較常用的細胞穩定轉染抗性篩選試劑。G418能阻斷蛋白質合成,對細菌、酵母、高等植物以及哺乳動物細胞均具有氨基糖苷類毒性,用于真核細胞從轉                              座子Tn5和Tn601穩定轉染新 霉 素(neo)抗性基因的選擇和維持,經常用于基因轉移、基因敲除、抗性篩選以及轉基因動物等方面。

            本品經過濾除菌,一般工作濃度為50~1000ug/ml不等,不同類型的細胞需要根據實驗確定合適濃度。在具有相對穩定基因組的細胞(如CHO細胞)中,一旦篩選出穩定細胞株后,無需                              加入G418即可繼續培養。

       

      產品包裝                     

      25mg/ml G418溶液,無菌            1ml        1kit

       

      使用方法                   

      1.由于每種細胞對G418的敏感性不同,而且不同批次的G418的活性液不同,所以在篩選之前,需要確定G418的最佳篩選濃度,一般在50-1000μg/m范圍內進行篩選

      2.將細胞制備成細胞懸液,并稀釋到1000個/ml。

      3.加入不同量的G418 solution(20mg/ml),選擇在10-14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。

       

      注意事項                   

      1.盡量減少反復凍融的次數,以免失效。

      2.基因轉染到細胞內要一段時間才能表達出蛋白質,所以篩選不能太早

      3.篩選也不宜太遲,一般要在轉染24h之后才開始加G418篩選。因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大,增值較慢,時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒,最終導致篩選不出陽性克隆。

      4.隨著細胞代謝,G418的濃度和活性都會下降,應每3-5天更換一次含有G418的篩選液,這時藥物濃度可以降至200ug/ml。

      5.加藥篩選約57天左右,細胞會大量死亡,為了減少死亡細胞對陽性克隆的不利影響以及增加陽性克隆的得到率,可以應用套環法或刮除法結合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后,在高倍鏡下,刮除陰性克隆消化陽性克隆后繼續篩選培養?;蛘哂锰篆h套住陽性克隆,在套環內加膚蛋自酶成EDA消化,把消化液吸到另外一個新的孔中培養,最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。

      6.般經過4周左右的篩選,得到的陽性克隆都比較穩定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話,目的基因還是很容易丟失的,再次篩選往往是必不可少的,經過2次以上的篩選之后才能找到遺傳穩定的細胞克隆。

      7.盡量避免污染。

      8.為了您的安全和健康,請穿戴實驗服并戴一次性手套操作。