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      RIPA裂解液弱(無抑制劑)
      2020年7月21日
      RIPA裂解液中(無抑制劑)
      2020年7月23日

      RIPA裂解液強(無抑制劑)

      100.00


      貨號: RBP102-100.
      描述

      RIPA裂解液(無抑制劑)

       

      貨號                                       RBP102-100

      規格                                       100ml

      無菌狀態                                 無菌

      應用級別                                 生物試劑級別

      生產環境最低要求                     開放車間

      4C2T體系認證級別                   C3T1

      儲存及運輸條件                        0-4℃儲存及運輸

      效期                                        遵儲存及運輸條件穩定12個月

       

      簡介                                 

      多種成分均可從細胞中提取總蛋白,如 Triton、SDS、NP-40 等。RIPA 裂解液(弱)是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質可用于PAGE 電泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。

      本品主要由 Tris、NP-40、sodium deoxycholate 等組成,并含有多種蛋白酶抑制劑成分,可以有效抑制蛋白的降解,并維持原有的蛋白間相互作用。

       

      產品包裝                             

      RIPA裂解液強(無抑制劑)                100ml    1瓶

      使用方法                             

      (一)貼壁培養細胞

      1.取本品置于室溫溶解混勻,加入PMSF,使 PMSF 終濃度為 1mM。

      2.去除貼壁細胞的培養液,用 PBS、NS 或無血清培養液清洗 1 次,低速離心,棄上清,留取沉淀。

      3.按照 6 孔板每孔加入 150~250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 本品。移液器輕輕吹打,使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上或 4℃裂解,通常裂解液作用于細胞 1~3s內,細胞就會被裂解。通常 6 孔板每孔細胞加入 150μl 裂解液已經足夠,但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到 200~250μl。

      4.10000~12000g,4℃離心 5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。

      5.后續的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

      (二)懸浮培養細胞

      1.取 本品 置室溫溶解混勻后,加入 PMSF,使 PMSF 終濃度為 1mM。

      2.低速離心懸浮細胞,棄上清,收集沉淀。

      3.用手指輕彈細胞,使其松散。按照 6 孔板每孔細胞加入 150~250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 本品。通常 6 孔板每孔細胞加入 150μl 裂解液已經足夠,但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到 200~250μl。再用手指輕彈以充分裂解細胞,充分裂解后應沒有明顯的細、胞沉淀。

      4.10000~12000g,4℃離心 5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。

      5.進行后續的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

      (三)組織樣本

      1.取 本品 置于室溫溶解混勻后,加入 PMSF,使 PMSF 終濃度為 1mM。

      2.把組織剪切成細小的碎片,越小越好。

      3.取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織,迅速用液氮研磨,研磨過程盡量控制在 1~2min 之內,以減少蛋白的降解。

      4.按照每 20mg 組織加入 150~250μl 裂解液的比例,加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或4℃裂解 15~30min。

      5.步驟 3、4 亦可以采用如下過程:按照每 20mg 組織加入 150~250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 本品。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,直至充分裂解,該過程盡量控制在 1~2min 之內,以減少蛋白的降解。

      6.10000~12000g,4℃離心 5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。

      7.進行后續的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

       注意事項                         

      1.去除貼壁細胞的培養液后,如果血清中的蛋白沒有干擾,可以不用清洗。

      2.如果裂解不充分可以適當增加裂解液的用量,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。

      3.如果細胞量較多,必需分裝成 50~100 萬細胞/離心管,然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分,而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸,相對比較容易裂解充分。

      4.如果組織樣品本身非常細小,可以適當剪切后直接加入裂解液裂解,通過強烈 Vortex 使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,用于后續實驗。直接裂解的優點是比較方便,不必使用勻漿器,缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

      5.在低溫情況下有可能出現渾濁現象,可 37℃水浴促其溶解,不會影響使用效果;溶解時間不易過長,避免有效成分失效。

      6.裂解產物中經常會出現一小團透明膠狀物,屬正?,F象。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的復合物。在不檢測和基因組 DNA 結合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續實驗;如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續實驗。

      7.細胞裂解的操作步驟,應置于冰上或 4℃進行。

      8.為了您的安全和健康,請穿戴實驗服并戴一次性手套操作。